جهان زیست شناسیWorld of Biology

لام مخصوص: برای اندازه گیری تعداد نمونه در واحد حجم احتیاج به وسیله یا لامی است که حجم مشخصی را برای شمارش در اختیار آزمایش کننده قرار دهد. در این آزمایش از لام هموسیتومتر استفاده می گردد.لام های مخصوص شمارش گلبول های خون انواع مختلفی دارند مانند لام توما، نئوبار، اسپنسر، تورک و ... که توسط کارخانه های مختلف عرضه می شوند ولی لام هموسیتومتری که از همه دقیق تر و بهتر است، لام نئوبار می باشد. لام هموسیتومتر صفحه شیشه ای نسبتا ضخیمی است که سطح آن توسط شیارهایی به چند قسمت تقسیم می شود به طوری که دو شیار کناری و یک شیار وسط شکلی شبیه H را می سازند. در وسط دو مستطیل میانی دو بخش براق و آیینه مانند دیده می شود که دو صفحه مشبک مانند(+) را پوشش می دهند. دو صفحه مشبک مانند در بالا و پایین لام تکرار شده و مشابه می باشند. بدین ترتیب با یک بار تهیه لام، شما دوبار قادر هستید که نمونه ها را به طور تصادفی مورد شمارش قرار داده و میانگین تصادفی دو بار شمارش را به صورت عدد نهایی گزارش کنید. بخش مدرج از تعداد زیادی خطوط موازی جهت شمارش تشکیل شده است. در هر کدام از این صفحات 9 مربع بزرگ به ابعاد یک میلی متر در یک میلی متر وجود دارد. مربع میانی خود به 25 مربع متوسط و هر مربع متوسط نیز به 16 مربع کوچک تقسیم شده است( هر 16 مربعی توسط خطوط مضاعف محصور شده است.) به عبارتی مربع بزرگ به 400 مربع کوچک تقسیم شده است. زمانی که لامل روی لام قرار گیرد، ارتفاع هر صفحه مدرج تا لامل 0/1 میلی متر خواهد بود. پس حجم ایجاد شده در این فضا 0/1میلی متر مکعب می باشد. در چهار گوشه صلیب مدرج، چهار مربع دیگر به ابعاد یک میلی متر در یک میلی متر به چشم می خورد که تقسیمات آن با مربع بزرگ میانی متفاوت است. پس هریک از اضلاع این مربع ها به چهار بخش تقسیم شده است، یعنی هر مربع کناری، 16 مربع کوچکتر را تشکیل می دهد که این مربع ها برای شمارش گلبول های سفید (که تعداد آن ها از گلبول های قرمز کمتر است) به کار می روند.

لام هموسیتومتر توما مانند لام هموسیتومتر نئوبار است با این تفاوت که چهار مربع کناری را ندارد و فقط دارای مربع مرکزی مخصوص شمارش گلبول های قرمز می باشد.

پیپت ملانژور مخصوص شمارش گلبول های قرمز: هر پیپت دارای یک قسمت حباب مانند و یک قسمت موئینه می باشد. روی این پیپت سه عدد 0/5، 1 و 101 به ترتیب نوشته شده است به طوری که دو عدد 0/5 و 1 در زیر حباب و 101 در بالای حباب قرار دارند. در داخل حباب یک گرانول قرمز رنگ برای مخلوط کردن خون با مایع رقیق کننده وجود دارد. این ملانژور می تواند خون را به نسبت 1 به 200 رقیق کند( اگر تا عدد 1 خون و سپس تا عدد 101 محلول رقیق کننده وارد پیپت شود، خون به میزان صد برابر رقیق شده است و در صورتی که تا عدد 0/5 خون و سپس تا عدد 101 محلول رقیق کننده وارد شود، خون به میزان 200 برابر رقیق شده است.).

پیپت ملانژور مخصوص شمارش گلبول های سفید: دارای سه عدد 0/5، 1 و 11 می باشد که دو عدد 0/5 و 1 در زیر حباب و 11 در بالای حباب قرار دارند. داخل حباب یک گرانول سفید رنگ برای مخلوط شدن خون با محلول رقیق کننده وجود دارد. این ملانژور می تواند خون را به نسبت 1 به 20 رقیق نماید (اگر تا عدد 1 خون و تا 11 رقیق کننده وارد شود، خون 10 برابر رقیق شده است و اگر تا عدد 0/5 خون و تا 11 رقیق کننده وارد شود، خون به میزان 20 برابر رقیق خواهد شد.).

لوله لاستیکی تورنیکت: جهت مکیدن خون و محلول رقیق کننده به درون ملانژور استفاده می شود. این لوله 25-12 سانتی متر طول دارد تا در هنگام کشیدن خون و محلول، چشم قادر به دیدن درجات باشد. از طرفی جدار لوله پلاستیکی باید از جنسی مقاوم باشد تا در هنگام مکش خون روی هم نخوابد.

محلول رقیق کننده: می تواند محلول هایم (محلول ایزوتونیک) یا سالین 2 درصد باشد. برای تهیه سالین 2 درصد می توان 2 گرم نمک طعام را در 100 میلی لیتر آب حل نمود. این محلول نسبت به محلول داخل سلولی هیپرتونیک است. علت استفاده از محلول رقیق کننده، زیاد بودن تعداد گلبول های قرمز و عدم توانایی در شمارش آنها می باشد، پس باید آن ها را رقیق کرد. هرچه تراکم بیشتر باشد، رقت نیز باید بیشتر گردد. پس بهتر است در شمارش گلبول های قرمز از رقت 200 استفاده شود.

مواد و وسایل مورد نیاز:

میکروسکوپ، لام هموسیتومتر، لامل سنگی، ملانژور مخصوص شمارش گلبول های قرمز، تورنیکت، پنبه، الکل، لانست، محلول رقیق کننده.

روش انجام آزمایش:

مقداری از محلول را در بشر کوچکی می ریزیم زیرا بعد از آزمایش دور ریخته می شود. از خون ضد انعقاد دار یا خون گرفته شده توسط لانست استفاده می کنیم. لانست زدن را با یک ضربه سریع و محکم روی انگشت ضد عفونی شده با الکل (خشک شده) انجام داده و خراش مناسب را ایجاد می کنیم.

نوک پیپت ملانژور را با زاویه 45 درجه در قطره خون قرار داده و توسط تورنیکت خون را تا علامت 0/5 به درون پیپت می کشیم. می توانیم پیپت را با پایین تر نگه داشتن آن از حالت افقی و توسط نیروی کشش زمین نیز پر کنیم. اگر خون بالاتر از خط مورد نظر قرار گرفت، با قرار دادن پنبه ای در دهانه پیپت اضافی آن را خارج می کنیم. دقت شود که نوک پیپت از روی قطره خون روی انگشت خارج نشود تا حباب هوا وارد پیپت نگردد. در صورت ورود هوا در پیپت دمیده و خون را خارج و عملیات را مجددا تکرار می کنیم. هم چنین از فشار دادن موضع جلوگیری می کنیم زیرا سبب خروج آب میان بافتی و رقیق شدن خون می شود. سپس اطراف پیپت را تمیز نموده و آن را وارد ظرف حاوی محلول رقیق کننده کرده و تا علامت 101 پیپت را پر می کنیم. رقیق کردن خون باید به سرعت انجام شود، در غیر این صورت خون در پیپت لخته خواهد شد. پس از مخلوط شدن خون با محلول رقیق کننده، دیگر خطر انعقاد وجود ندارد. تورنیکت را از ملانژور جدا نموده و ملانژور را به مدت 3-2 دقیقه در دستگاه تکان دهنده ملانژور یا شیکر مخصوص آن قرار می دهیم. در صورت نبود این دستگاه، با دو انگشت شست و سبابه دو انتهای ملانژور را گرفته و 5 دقیقه تکان می دهیم تا خون به خوبی با محلول رقیق کننده در حباب مخلوط شود. سپس تورنیکت را مجددا وصل نموده و ملانژور را افقی روی میز قرار می دهیم. لامل را روی لام هموسیتومتر قرار داده و عدسی 40 را روی مربع 25 تایی متوسط تنظیم می نماییم. با دمیدن، 4-3 قطره از محتویات ملانژور را دور ریخته (زیرا لوله باریک ملانژور فقط حاوی محلول رقیق کننده است.) و قطره پنجم را به حدفاصل لام و لامل تماس می دهیم. طبق خاصیت موئینگی مایع رقیق شده بین لام و لامل پخش می شود(در صورت لزوم لامل را کمی از دو طرف در محل تکیه گاه فشار داده تا اگر مایع اضافی زیر لامل است به شیارهای دوطرف بریزد و یا اگر دارای حباب هوا است، حباب از محوطه خارج شود.).

پس از قرار دادن قطره پنجم کمی صبر می کنیم تا گلبول ها بی حرکت شوند و با تغییر فاز میکروسکوپ، گلبول ها را به صورت واضح می یابیم. گلبول های موجود در چهار خانه کناری و یک خانه وسطی از 25 خانه مربع متوسط را می شماریم. برای جلوگیری از شمارش تکراری، گلبول های موجود بر روی خطوط سه گانه سمت چپ و بالا را شمرده و هم چنین گلبول های موجود در 16 خانه کوچک را به طریق زیکزاکی می شماریم. 

از دو روش می توان تعداد گلبول های قرمز را محاسبه نمود.

روش اول: تعداد گلبول های قرمز شمرده شده در 5 خانه متوسط را با هم جمع و در عدد 10000 ضرب می کنیم. پس تعداد گلبول ها در هر میلی متر مکعب خون شخص بدست می آید.

N= N1+N2+N3+N4+N5

X=10000 × N

روش محاسبه ضریب 10000: اگر تعداد گلبول های قرمز در 5 مربع وسط یا به عبارتی در 80 مربع کوچک(16×5) را A فرض کنیم، روابط زیر بدست می آید:

میانگین تعداد گلبول های قرمز در یک مربع کوچک 

                                           A/80=B

تعداد گلبول های قرمز در 400 مربع کوچک( در حجم 0/1 میلی متر مکعب)        

C= B × 400

 تعداد گلبول های قرمز در یک میلی متر مکعب خون رقیق شده               

           D= C × 10

تعداد گلبول های قرمز در یک میلی متر مکعب خون                                             

      E= D × 200

با شناخت این راه محاسبه می توان به همان نتیجه رسید:

E= A × 10000

روش دوم: می توان میانگین تعداد گلبول های قرمز شمرده شده در 5 مربع متوسط را بدست آورد و آن را N نامید.

 سپس تعداد گلبول های قرمز را از رابطه زیر بدست می آوریم:

تعداد گلبول های قرمز در یک میلی متر مکعب خون= N×200×10×25

200 ضریب رقت، 10 ضریب حجم و 25 ضریب شمارش می باشد.

در صورتی که تعداد گلبول های قرمز بیشتر از مقدار طبیعی باشد، فرد مبتلا به پلی سیتمی و در صورتی که تعداد گلبول های قرمز کمتر از مقدار طبیعی باشد، فرد مبتلا به آنمی است ( در لوسمی تعداد گلبول های قرمز کمتر از مقدار طبیعی می باشد.)

در پایان آزمایش، پس از تخلیه محتویات باقی مانده در پیپت، آن را با آب شستشو می دهیم. سپس با ورود و خروج الکل، آب باقی مانده در پیپت را خارج می کنیم و در نهایت پیپت را با استون یا مواد مشابه آن شستشو داده تا الکل را خارج نماید. سپس لوله ها را توسط هوای فشرده یا مکیدن هوا از داخل آن خشک می کنیم. در صورتی که ملانژور خشک شده باشد، گرانول به کناره های حباب نخواهد چسبید.

در آزمایشگاه هرگز لام هموسیتومتر را با الکل یا اتر شستشو ننمایید. لام را با آب مقطر و یک پارچه کتانی جاذب رطوبت و بدون پرز تمیز نمایید.

 سوالات:

1)     در رقیق کردن یک محلول حجم را به 100 می رسانیم، پس چرا در رقیق کردن خون برای شمارش گلبول های قرمز حجم نهایی را به 101 می رسانیم؟

2)     نقش سالین 2 درصد چیست؟

3)     چرا باید الکل استفاده شده قبل از لانست زدن خشک شود؟

4)     تعداد گلبول های قرمز بر حسب سن، جنس و ارتفاع از سطح دریا متفاوت است. دلیل این تفاوت ها چیست؟

5)     در بیماری هایی مانند اسهال و سوختگی شدید میزان گلبول های قرمز چه تغییری پیدا می کند؟

6)      عواملی که سبب پلی سیتمی و آنمی می شوند را ذکر کنید.